液相色谱柱是液相色谱仪的核心部件,且极易因使用不当而损坏,不互溶的流动相,不正确的保存方式及清洗都会降低色谱柱的使用寿命。因此液相色谱柱的日常维护保养极为重要。
1.流动方向已明确标明在色谱柱上,请正确安装色谱柱,除非您想冲洗色谱柱入口的污染物,否则,请不要反接色谱柱。
2.反相柱做完实验后,若使用流动相中含有缓冲溶液盐,请在使用完毕后用不含缓冲剂的80%水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱,后换成100%有机溶剂贮存。
3.正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷中,反相使用时需要将柱内贮存液用异丙醇置换。
4.流动相与样品在使用前可以用0.45um的微孔滤膜或用预处理柱(SPE固相萃取小柱)进行预处理,并严格脱气。
5.流动相pH需保持在2-8之间,请尽量不超过适用范围。
6.柱温不要大于60℃。
7.压力最高不超过30Mpa,建议在20Mpa以内使用。
8.使用新鲜溶剂,防止细菌增长。
液相色谱仪根据固定相是液体或是固体,又分为液-液色谱(LLC)及液-固色谱(LSC)。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较,具有高效、快速、灵敏等特点。对高沸点、难气化合物的混合物通过色谱柱核淋洗剂并以实现分离。应用于生物化学、生物医学、环境化学、石油化工等部门。
液相色谱仪3大系统
系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统,下面将分别叙述其各自的组成与特点。
1.进样系统
液相色谱仪一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。
2.输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X10Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而改变,包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。
3.分离系统
该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。另外,固定相基质粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低涡流扩散效应。基质粒度小,微孔浅,样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析,基质粒度小,塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小,会提高分辨率的道理。再者,高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度,缩短分析时间,就可增加层析柱的效率。
1、一般定性
用已知物和直接对照法定性,这是一种相对可靠的方法,主要可以分为以下四种:
1)保留时间和保留体积
2)相对保留值
3)已知物增加峰高法
4)双柱货双体系
实验表明,各类同系物在两根不同柱上的Vg值有如下关系:
式中:VgI表示在柱I上的比保留体积;VGII表示在柱II上的比保留体积;A1与C1为常数。
从上式可以看出,同系物在两个性质不同的色谱柱上,比保留体积Vg的对数有线性关系,下图就是根据某些化合物和领苯二甲酸二异葵酯柱上的比保留体积的对数制作出的。
经过领苯二甲酸二异葵酯柱分离后,在lgvgII为1.8的位置上有一个未知峰,由图可看出有两种可能性,即酮与伯醇;此时,将样品在柱上I上进行分离,得到lgVgII为1.62的色谱峰,从而可确定该峰是酮而不是醇。
在液相色谱中,可用双体系定性,通过改变流动相和固定相,从而改善分离的选择性,通常改用与原色谱体系有较大差别的其他色谱体系来实现分离。
2、保留值分随份子结构或性质变化的规律
1)GC中的碳数规律:同系物间,在一定温度下,保留值变化遵循如下规律:
2)GC中的沸点规律:同族具有相同碳原子数目的同分异构体间存在如下关系:
3)LC中的保留值规则:对于份子中存在不同数目的重复官能团的化合物,有如下的经验公式:
3、反向液谱的定性
在气谱中广泛使用的Kovats指数定性,在夜谱中,由于组分的保留行为不仅与固定相有关,还与流动相的种类及浓度有关,所以不能直接用同系物间,在一定温度下,保留值变化遵循如下规律指数定性。
4、计算机检索
计算机不仅都能贮存大量保留指数,而且还可以将库中标准数据转换为用户色谱条件下保留指数和tR值,靠检索功能定性。
5、色谱中的辅助技术
液相色谱,对于未知物结构的确定,也常常使用一些辅助技术,常用的有质谱,红外,核磁等。
使用非在线联用技术时,首先将色谱分离后的纯样品收集。