分析仪器工作者要懂得仪器的日常维护和对主要技术指标的简易测试方法,自己经常对仪器进行维护和测试,以保证仪器工作在较佳状态。
一、温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。他们可以引起机械部件的锈蚀,使金属镜面的光洁度下降,引起仪器机械部分的误差或性能下降;造成光学部件如光栅、反射镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀,产生光能不足、杂散光、噪声等,甚至仪器停止工作,从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正。应具备四季恒湿的仪器室,配置恒温设备,特别是地处南方地区的实验室。
二、环境中的尘埃和腐蚀性气体亦可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电偶合器的可靠性,也是造成必须学部件铝膜锈蚀的原因之一。因此必须定期清洁,保障环境和仪器室内卫生条件,防尘。
三、仪器使用一定周期后,内部会积累一定量的尘埃,可以由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作,同时将各发热元件的散热器重新紧固,对光学盒的密封窗口进行清洁,必要时对光路进行校准,对机械部分进行清洁和必要的润滑,最后,恢复原状,再进行一些必要的检测、调校与记录。
紫外分光光度计是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外分光光度计可以在紫外可见光区任意选择不同波长的光。物质的吸收光谱就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量,相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。下面小编就为您介绍一下紫外分光光度计组成部分:
各种型号的紫外可见分光光度计,就其基本结构来说,都是由五个基本部分组成,即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。
1.光源
在紫外可见分光光度计中,常用的光源有两类:热辐射光源和气体放电光源。
热辐射光源用于可见光区,如钨灯和卤钨灯;气体放电光源用于紫外光区,如氢灯和氘灯。
2.单色器
单色器的主要组成:入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。
单色器质量的优劣,主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。
3.吸收池
吸收池又称比色皿或比色杯,按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池,前者不能用于紫外区。吸收池的种类很多,其光径可在0.1~10cm之间,其中以1cm光径吸收池较为常用。
4、检测器
检测器的作用是检测光信号,并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。
5、信号显示系统
常用的信号显示装置有直读检流计,电位调节指零装置,以及自动记录和数字显示装置等。
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。
蛋白质的直接定量(UV法)
这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质,一般要消除320nm的“背景”信息,设定此功能“开”。与测试核酸类似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,较佳的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时,发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上,只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%,表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度,乘以一定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的混合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。